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Protección vascular por cloroquina durante el tratamiento del tumor cerebral con Tf-CRM107 Naoshi Hagihara. Stuart Walbridge. Alan W. Olson. Edward H. Oldfield. y el Instituto de Richard J. Youle 1 Bioquímica y Secciones clínicos, quirúrgicos Branch Neurología, Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares NHSWEHORJY, y en Vivo Centro de Investigación de RMN Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares AWO, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland 20892 Resumen Tf-CRM107 es un conjugado de transferrina y un punto mutante de la toxina diftérica que mata selectivamente las células que expresan altos niveles de receptor de transferrina. Tf-CRM107 se ha infundido por vía intratumoral en pacientes con tumores cerebrales malignos. Aunque aproximadamente la mitad de los pacientes presentan respuestas tumorales, los pacientes que recibieron dosis más altas de Tf-CRM107 pueden desarrollar una imagen de resonancia magnética (MRI) evidencia de toxicidad indicativo de trombosis de los vasos pequeños o hemorragia petequial. De acuerdo con estos resultados clínicos, se encontró que la inyección intracerebral de Tf-CRM107 en ratas a dosis total de 0.025 g causa daño cerebral detectable por resonancia magnética y la histología. Para ampliar la ventana terapéutica de Tf-CRM107, exploramos las formas de prevenir este daño a la vasculatura. Pensamos que la vasculatura puede ser protegido en una medida mayor que tumor de Tf-CRM107 infunde en el parénquima cerebral por la administración i. v. la inyección de los reactivos con baja permeabilidad de la barrera hematoencefálica que bloquean la toxicidad de Tf-CRM107. La cloroquina, un medicamento contra la malaria bien caracterizado, bloquea la toxicidad de la toxina de la difteria y Tf-CRM107. La administración sistémica de cloroquina bloqueó la toxicidad de Tf-CRM107 infundido por vía intracerebral en ratas y cambió la dosis máxima tolerada de Tf-CRM107 0,2-0,3 g. Además, el tratamiento con cloroquina bloqueó completamente el daño cerebral detectado por resonancia magnética causado por la infusión intracerebral de 0,05 g de Tf-CRM107. En ratones desnudos portadores de s. c. gliomas U251, tratamiento con cloroquina tuvieron poco efecto sobre la eficacia antitumoral de Tf-CRM107. Así, el tratamiento de cloroquina puede ser útil para reducir la toxicidad de Tf-CRM107 para cerebro normal sin inhibir la eficacia antitumoral y aumentar la ventana terapéutica de Tf-CRM107 para la terapia de tumor cerebral. Introducción El pronóstico de los pacientes con tumores cerebrales malignos es pobre a pesar de la terapia estándar (cirugía, radiación y quimioterapia). Tf-CRM107 (1). un conjugado de Tf2 y una DT mutante que carece de la función de unión al receptor (2). puede apuntar y matar células que expresan Tf-R, tales como células tumorales. El potencial de Tf-CRM107 para la terapia de tumores cerebrales ha sido explorado in vitro (1). en modelos animales (3). y en pacientes con gliomas malignos (4). Cuando se entrega por alto flujo (410 l / min) microinfusión intersticial CED (5). infusión intratumoral de Tf-CRM107 en pacientes con tumores cerebrales malignos produce respuestas tumorales (4). Cuando se utiliza CED, Tf-CRM107 (140 kDa) se distribuye preferentemente en el espacio intersticial del tumor y el cerebro que rodea infiltrado por tumor y evita la BBB. Sin embargo, en el cerebro, las células endoteliales capilares expresan niveles bajos de Tf-R (6). y en dosis altas Tf-CRM107 puede causar déficits neurológicos consistentes con el daño endotelial. MRI en estos pacientes ha puesto de manifiesto cambios en el cerebro consistentes con la oclusión microvascular y / o hemorragia petequial (4). Nuestro objetivo era proteger selectivamente los capilares del sistema nervioso central de la toxicidad Tf-CRM107 sin protección de las células tumorales del cerebro. Se buscó un fármaco con baja permeabilidad de la BHE que podrían ser entregados por vía i. v. para proteger la vasculatura. aminas lisosomotróficos, como la cloroquina, se usan clínicamente para tratar la malaria y ciertas enfermedades del colágeno. Estos fármacos se acumulan en los lisosomas y aumentar y neutralizan pH vesicular (7). DT entra en la célula para inhibir la síntesis de proteínas, utilizando el bajo pH de los endosomas y lisosomas para desencadenar el transporte en el citosol (8. 9. 10. 11). Así, los bloques de cloroquina la citotoxicidad de DT (12) y es probable Tf-CRM107. Se investigó el potencial de la cloroquina para mejorar la utilidad de inmunotoxinas para la terapia de tumor cerebral suprimiendo selectivamente la toxicidad a la vasculatura sin alterar la eficacia antitumoral. Materiales y Métodos Líneas celulares y animales. La línea celular de glioblastoma humano U251MG y línea celular de gliosarcoma de rata 9L se adquirieron de la American Type Culture Collection. Ambas líneas celulares se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10 FCS y mantenidos a 37ºC en un entorno de 5 CO 2. Los experimentos con animales se realizaron con macho Fisher 344 ratas (Taconic), 2025 semanas de edad, con un peso corporal de 250 a 300 g y NIH ratones nu / nu hembra 46 semanas de edad, que fueron atendidos en conformidad con las directrices del NIH. DT, Tf-CRM107, y cloroquina. DT se adquirió de List Biologicals (Campbell, CA). Preparación de la CRM107 mutante DT y su conjugación con Tf humana se realizaron como se ha descrito previamente (1). La toxina y Tf estaban unidos por un enlace tioéter. sal de cloroquina difosfato (515,9 Da) se adquirió de Sigma (St. Louis, MO). Las toxinas y cloroquina se disolvieron en PBS para experimentos in vitro y en solución salina fisiológica 0,9 para los experimentos in vivo. Tf-R Expresión. El anticuerpo anti-Tf-R monoclonal de ratón se adquirió de Zymed Laboratories (San Francisco, CA). Este anticuerpo (H68.4) es específica a los residuos 328 de la cola Tf-R N-terminal humana y reacciona de forma cruzada con la rata Tf-R. El cerebro normales, cerebelo, pons, médula, y el segmento cervical de la médula espinal fueron retirados de ratas, y los tumores fueron retirados de ratas portadoras de tumores 9L cerebro 14 días después de la inoculación del tumor y se congeló inmediatamente en isopentano preenfriado con hielo seco. Los tejidos congelados se homogeneizaron con 1 Triton X-100 en PBS y se centrifugaron a 800 g. y el sobrenadante se guardó. La concentración de proteína de cada muestra de tejido se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL). Cantidades iguales de proteína fueron separadas en 412 Tris-Glicina Gel (Novel Tecnología Experimental, San Diego, CA) con un volumen igual de tampón de muestra Tris-glicina SDS 2X (Novex). Las proteínas separadas por PAGE se sometieron a electrotransferencia en membranas Immobilon PVDF (Millipore, MA) utilizando TRNSBLOT (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Después de bloquear con 0,05 Tween 20 (Sigma) en PBS (pH 7,4) que contiene 5 FCS, las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las membranas se lavaron y se incubaron con rábano picante oveja conjugado con peroxidasa anti-ratón de anticuerpos IgG (Amersham Pharmacis Biotech, Inc. Piscataway, NJ). Después de un lavado a fondo, las proteínas inmunorreactivas se visualizaron mediante el sistema ECL de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham). En Vitro Ensayo de citotoxicidad. La toxicidad de Tf-CRM107 a U251MG células después de tratamiento con cloroquina se estudió usando 14 Cleucine incorporación como una medida de la síntesis de proteínas, como se informó anteriormente (1). En pocas palabras, después de las células U251MG se incubaron con RPMI libre de leucina 1640 por 6 h, se añadió cloroquina y se incubó durante 1 h. Varias dosis de Tf-CRM107 (7 10 15 7 10 a la 8 m) se añadieron a continuación 12 horas más tarde, se añadieron 0,1 Ci de 14 Cleucine, se continuó la incubación durante 1 h, y después se recogieron las células. Todos los ensayos de citotoxicidad se realizaron tres veces. Los resultados se expresaron como un porcentaje de 14 Cleucine incorporación en los cultivos de control tratados de forma simulada y se expresaron como medias SE. Evaluación MTD. Después de (inyección i. p. de 80 mg / kg de ketamina y 12 mg / kg de xilazina) la anestesia, las ratas se colocaron en un marco estereotáxico. Se hace una incisión en la línea media sagital se hizo, y se utilizó un taladro dental para colocar un agujero de trépano 3 mm lateral y 1 mm anterior al bregma. Las toxinas fueron infundidos para la determinación de MTD en un volumen de 5 l por vía intracerebral en ratas a 1 l / min, utilizando una jeringa de 10 l Hamilton. DT se le dio para alcanzar la dosis total de 0.0250.2 g, y Tf-CRM107 fue dado para alcanzar la dosis total de 0.10.5 g. Las ratas recibieron inyecciones i. p. inyecciones de cloroquina (45 mg / kg n 41) o vehículo (solución salina fisiológica 0,9 N 39) 5 min antes de la inyección intracerebral y una vez cada día durante 5 días consecutivos. Hemos observado todas las ratas durante al menos 14 días. Si los animales mostraron signos de angustia (letargo, déficit neurológico, o la incapacidad para obtener alimento y agua), que fueron sacrificados y decapitados, y los cerebros se retiraron inmediatamente para histología. Se consideró que la dosis máxima de toxina inyectada por vía intracerebral que no causó angustia a ser el MTD. RM. MRI se realizó en ratas bajo anestesia (inyección i. p. de 80 mg / kg de ketamina y 12 mg / kg de xilazina) para detectar daño cerebral. Para la medición de la toxicidad en las condiciones de infusión idéntica a las mediciones de MTD, MRI se realizó 3 días después de la inyección con 0,4 g de Tf-CRM107 (1 l / min). El protocolo utilizado en estas imágenes era multicorte spin-eco hecho en un instrumento de perforación horizontal Tesla GE Omega 2 con 4 gauss / cm gradientes blindados. La imagen ponderada en T1 fue tomada con un TE / TR de 20/500 m con un tiempo de exploración total de 8,5 min. Las imágenes ponderadas en T2 se tomaron con un TE / TR 80/1500 ms de tiempo de exploración con un total de 51 min. Cada uno de estos cortes tenían una resolución digital en el plano de 390 metros y un grosor de corte de 2 mm. Para detectar el bloqueo completo de la toxicidad de Tf-CRM107 por cloroquina en el cerebro normal y para mejor modelo el método de infusión utilizado en los ensayos clínicos (CED), 0,05 g de Tf-CRM107 en 5 l se infundieron a 0,1 l / min con una presión gradiente mantiene utilizando una bomba de jeringa (Harvard Apparatus, S. Natick, MA), y la resonancia magnética se realizó 14 días después de la infusión. El protocolo utilizado en estas imágenes era multicorte hecho eco de espín en un Varian Inova 4,7 Tesla instrumento de perforación horizontal con 15 gauss / cm blindado gradientes. Estas imágenes ponderadas en T2 se tomaron con un TE / TR 80/2000 ms de espesor de corte fue de 1 mm con 1,5 mm entre centros rebanada. Cada una de estas rebanadas tenía una resolución digital en el plano de 390 m. Modelo de tumor. tumores de glioma humano U251MG sólido se cultivaron mediante la inyección de 10 7 células U251MG cultivadas s. c. en los costados de ratones desnudos. Se detectaron tumores palpables después de 45 semanas y alcanzaron 0.40.6 cm de diámetro. El tamaño del tumor se evaluó midiendo dos diámetros perpendiculares con calibres Vernier y el uso de la fórmula media LW 2. donde L es el diámetro más largo y W es el diámetro perpendicular a L. Grupos de cinco ratones desnudos con tumores en los flancos U251MG establecidos fueron asignados aleatoriamente para recibir inyecciones intratumorales con 100 l de PBS o Tf-CRM107 (100 g / ml la dosis total, 10 g) con o sin tratamiento con cloroquina. Los ratones recibieron i. p. inyecciones de cloroquina (45 mg / kg de N 5) o vehículo (0,9 de solución salina fisiológica n 5) 5 min antes de la inyección intratumoral de Tf-CRM107 y una vez al día durante 4 días consecutivos a la misma dosis. El volumen del tumor, evaluada durante 10 días, se representa como un porcentaje del volumen inicial y se expresa como una media SE. Resultados y Discusión Se compararon los niveles de Tf-R en diferentes regiones del cerebro de rata normal con el nivel de Tf-R en tumores cerebrales 9L. La Tf-R fue detectado como un homodímero (180 kDa) en las transferencias Western. normal del cerebro (cerebro, cerebelo, pons, médula, y el segmento cervical de la médula espinal) expresaron Tf-R con alguna variación en magnitud entre las diferentes regiones (Fig. 1 A. Lanes 15). El puente expresaron niveles particularmente bajos de Tf-R, posiblemente como consecuencia de la menor densidad capilar en la sustancia blanca de la materia gris. 9L tumores cerebrales 14 días después de la inoculación fueron también examinadas en los cerebros de ratas. El grado de expresión de Tf-R en tumores 9L fue mayor que la de la normal de CNS (Fig. 1 A. Carril 6). A, Western blot de Tf-R en 344 ratas Fisher. Treinta g de extracto de tejido se ejecuta en un SDS-PAGE y se tiñó con 412 un anticuerpo anti-Tf-R (Zymed). Las muestras de tejido fueron de rata normal (carriles 15), y ratas portadoras de tumores 9L cerebro 14 días después de la inoculación del tumor (carril 6). tumor cerebral 9L expresa más Tf-R en comparación con el SNC. B. T1-RM ponderada (izquierda) y la RM potenciada en T2 (derecha) escáneres de cerebro de rata de 3 días después de la infusión intracerebral con 0,4 g de Tf-CRM107. La gran área ocupacional representado hemorragia y edema involucrados. El isointensidad componente central en la resonancia magnética y baja intensidad en T1 (indicada por la flecha) en la RM potenciada en T2 representado glóbulos rojos intactos con desoxihemoglobina después de la hemorragia. El componente externo (de baja intensidad en la RM ponderada en T1 y alta intensidad en la RM ponderada en T2) representó el edema. Cuando 5 l de Tf-CRM107 se infunde en el cerebro de rata normal en 1 l / min, la dosis total de 0.025 g o daño cerebral causado más tales como necrosis y encephalomalacia detectado por la histología por día 14 después de la infusión. Estos resultados fueron consistentes con nuestros informes anteriores (3). Se examinó la toxicidad Tf-CRM107 de cerebro de rata por resonancia magnética. Resonancia magnética de los cerebros de ratas de 3 días después de la inyección intracerebral con 0,4 g de Tf-CRM107 reveló una lesión de masa con dos componentes de diferentes intensidades de señal en el lóbulo frontal derecho. El componente central fue isointenso en la RM ponderada en T1 y baja intensidad en la RM ponderada en T2 (Fig. 1 B. Flecha). Estos patrones de resonancia magnética son consistentes con los glóbulos rojos intactos que contienen desoxihemoglobina después de la hemorragia. El componente exterior era de baja intensidad en la RM ponderada en T1 y alta intensidad en la RM ponderada en T2 (Fig. 1 B), lo que indica un edema con la gran área profesional representante de la hemorragia y edema involucrados. Histología de la lesión mostró hemorragia con necrosis, pérdida de tejido, y la invasión de macrófagos (datos no mostrados). Estos cambios en el cerebro detectado por resonancia magnética y la histopatología indican que Tf-CRM107 causa daño vascular. Tf-CRM107 a dosis altas se puede unir a Tf-R sobre las células endoteliales capilares y causar trombosis hemorrágica y luego de miocardio, o puede causar directamente una hemorragia como resultado de lesión endotelial. La cloroquina es conocido para bloquear la toxicidad de DT in vitro (12). Encontramos cloroquina in vitro bloqueó la toxicidad de Tf-CRM107 10.100 veces, y a una concentración de Tf-CRM107 de 7 10 11 m. las células fueron completamente protegidos por 10 m de cloroquina (Fig. 2 A). A . toxicidad de Tf-CRM107 a U251MG células de glioma humano después de la exposición de 12 h con y sin cloroquina (1, 10, y 50 m). La cloroquina se añadió a las células 1 h antes de Tf-CRM107. Tf-CRM107 sin cloroquina () es el control. B. tasa de supervivencia después de la inyección intracerebral de toxinas en ratas. Las ratas recibieron inyecciones en el lóbulo frontal derecho con la dosis indicada de DT y Tf-CRM107. Se controlaron los síntomas neurológicos y la supervivencia de los animales. El porcentaje de supervivencia de los animales se representa (de tres a siete animales por grupo). Las ratas que recibieron 0,4 g de Tf-CRM107 mostraron signos clínicos de toxicidad. Hemos postulado que la administración sistémica de la cloroquina puede proteger el sistema vascular del SNC de Tf-CRM107 y disminuir la toxicidad del SNC in vivo. Examinamos el MTD de Tf-CRM107 con y sin administración de cloroquina. Después de la inyección intracerebral con 0,2 g de Tf-CRM107, no se observaron síntomas notables en cinco de cinco ratas. Sin embargo, cinco (71) de los siete ratas que recibieron 0,3 g de Tf-CRM107 mostraron signos de sufrimiento alrededor día 6 después de la inyección. Cinco de cinco ratas que recibieron 0,4 g de Tf-CRM107 murieron alrededor día 4. Sin embargo, si las ratas recibieron cloroquina (45 mg / kg) después de la inyección con 0,3 g de Tf-CRM107, cero de cinco animales mostró signos de sufrimiento. A pesar 0,4 g de Tf-CRM107 con cloroquina causó signos de dificultad de cada cuatro (80) de los cinco animales, la cloroquina se incrementó la tasa de supervivencia y cambió el MTD de Tf-CRM107 de 0,2 ga 0,3 g (Fig. 2 B). Por lo tanto, la cloroquina sistémica protege a los animales de la toxicidad intracerebral debido a Tf-CRM107. infusión intracerebral con 0,05 g de Tf-CRM107 causó daño cerebral histológico (es decir, necrosis) en el lóbulo frontal derecho el día 14. Toxicidad a esta dosis se detectó como una lesión de alta intensidad en T2 de resonancia magnética (fig. 3. izquierda ). la administración de cloroquina sistémica (45 mg / kg) bloqueó completamente el daño cerebral causado por 0,05 g de Tf-CRM107 en día 14 (n 3 Fig. 3. derecha). Imagen de resonancia magnética ponderada en T2 de una rata que recibió una infusión intracerebral con 0,05 g de Tf-CRM107 (10 g / ml) con 5 días i. p. inyección de cloroquina (45 mg / kg derecha) en comparación con una rata que recibió solución salina fisiológica 0,9 en lugar de la cloroquina (izquierda). Tf-CRM107 fue microinfused a 0,1 l / min usando una bomba de jeringa. cloroquina sistémica podría proteger la vasculatura del cerebro de intracerebral infundido Tf-CRM107. Si la cloroquina podría disminuir la toxicidad de Tf-CRM107 sin disminuir la eficacia antitumoral, una terapia mejorada para los tumores cerebrales puede ser posible. El BBB se puede esperar que limitar la cantidad de cloroquina que pueden pasar a las células tumorales, de baño cerebrales fluido cerebral, y puede prevenir suficientemente cloroquina de entrar en el cerebro para bloquear la actividad antitumoral de Tf-CRM107. Los cerebros de las ratas y los ratones son demasiado pequeños para modelar con precisión las infusiones de tumores cerebrales, por lo tanto, se utilizó una medida sustituta de la entrada de la cloroquina en el cerebro. Para evaluar si suficiente cloroquina atraviesa la BBB para inhibir la actividad antitumoral de Tf-CRM107, se utilizó DT nativa que tiene una sensibilidad similar a la cloroquina (1, 12). En contraste con Tf-CRM107, que dirige a las células endoteliales en el SNC, DT es selectivamente tóxico para las neuronas en el cerebro de rata (13) y por lo tanto se dirige a un tipo de célula en el lado del SNC de la acreditación como células tumorales del cerebro son. Se verificaron los efectos de la cloroquina sistémica en la tasa de supervivencia de las ratas inyectadas por vía intracerebral con DT. Aunque ninguno de los cuatro ratas que recibieron 0,1 g de DT mostró signos de sufrimiento, los cuatro ratas que recibieron 0,2 g de DT mostraron signos de peligro en todo el día 5. Cuando se inyectó por vía intraperitoneal cloroquina a 45 mg / kg, además de 0,2 g de DT intracerebral, los cuatro animales mostraron signos de sufrimiento alrededor de 5 días (Fig. 2 B). Por lo tanto, i. p. inyección de cloroquina no bloquea toxicidad de DT intracerebral. Aunque por vía intraperitoneal inyección de cloroquina parece alcanzar y proteger la vasculatura del cerebro de Tf-CRM107, no protege las neuronas del SNC de DT. tumores cerebrales de mejora del contraste pueden tener una acreditación parcial defectuoso, y esto puede permitir suficiente cloroquina en el tumor cerebro para bloquear la eficacia Tf-CRM107. Hemos probado esta hipótesis, utilizando un escenario del peor caso de la vasculatura tumoral con fugas en la periferia. Hemos inyectado Tf-CRM107 en tumores U251 cultivadas en los flancos de ratones desnudos con y sin i. p. inyección de cloroquina. La inyección intratumoral de Tf-CRM107 el crecimiento del tumor inhibió significativamente en comparación con PBS (P 0,01), y i. p. inyección de cloroquina a 45 mg / kg causó poco o ningún bloqueo de la eficacia de la Tf-CRM107 contra la s. c. tumor (Fig. 4). Los cambios en U251MG s. c. el volumen del tumor después de la infusión intratumoral de Tf-CRM107. Grupos de cinco ratones desnudos con tumores en los flancos se asignaron al azar para ser inyectado por vía intratumoral con 100 l de PBS o 100 l de Tf-CRM107 (dosis total, 10 g) con o sin i. p. tratamiento con cloroquina. El volumen del tumor se representa como el porcentaje de volumen inicial, evaluada durante 10 días y se expresó como bares medias. SE. Tf-CRM107 infundido por vía intratumoral usando alto flujo microinfusión intersticial en pacientes con tumores cerebrales malignos recurrentes causados al menos un 50 reducción en el volumen del tumor en 8 de 15 pacientes (4). Para mejorar este resultado, hemos considerado la forma de aumentar la dosis de Tf-CRM107 segura en más efectivamente erradicar las células tumorales. En ese estudio clínico peritumoral, lesión cerebral focal se produjo en todos los pacientes que recibieron 40 g de Tf-CRM107 a 1 g / ml. El análisis histológico de la biopsia reveló trombosis vénulas y / o capilares corticales. Por lo tanto, la toxicidad limitante de la dosis asociado a intratumoral infusión Tf-CRM107 en los seres humanos es consistente con el daño endotelial capilar cerebral. TF-Rs se expresan en las células endoteliales en el cerebro normal (6). Aunque la mayoría de TF-Rs aparecen en la luz capilar (6). Pueden ciclo a través de la célula para el lado abluminal en los que pueden unirse intracerebral Tf-CRM107. Las dosis altas de Tf-CRM107 pueden causar infarto hemorrágico tras trombosis de los vasos difusa o causa hemorragia directamente después de la unión a Tf-R sobre las células endoteliales capilares. la infusión intracerebral de Tf-CRM107 en los cerebros de ratas a dosis de 0,025 g causó daño en el SNC detectada tanto por la histología y la RM. Hemos detectado daños MRI en 40 g (aproximadamente 0,8 g / kg) de Tf-CRM107 en los seres humanos y en 0,025 g (aproximadamente 0,1 g / kg) en ratas. Esta discrepancia en MTD entre ratas y seres humanos puede de hecho ser debido a diferencias en el volumen de la velocidad de infusión o infusión en relación con el tamaño del cerebro. Debido a que puede ser plausible para infundir continuamente ratas durante 5 días a infusiones precisamente modelo en los seres humanos, no hemos podido comparar MTD directamente entre ratas y humanos mediante la misma técnica de entrega. Hemos tratado de superar la toxicidad limitante de dosis de Tf-CRM107. Para proteger los capilares normales de Tf-CRM107, hemos identificado un fármaco que bloqueara Tf-CRM107. DT tiene una serie de dominios hidrófobos (14, 15) que se insertan en las membranas cuando se expone al bajo pH presente en los endosomas y lisosomas (8. 9. 10. 11). bloques Cloroquina la toxicidad de DT mediante el aumento y la neutralización de pH endosomal (7, 12) y bloques de la toxicidad de Tf-CRM107. La cloroquina puede también aumentar la supervivencia de las ratas después de la infusión intracerebral Tf-CRM107 y evita los cambios de resonancia magnética asociados con la toxicidad. La alta intensidad de señal en la RM ponderada en T2 después de la infusión de Tf-CRM107 puede reflejar el daño histológico debido a vasos capilares en trombos o hemorragia petequial. En términos generales, MRI ponderada en T2 es muy sensible para la detección de este tipo de daño cerebral. El tratamiento con cloroquina protegida animales de este daño causado por Tf-CRM107. Se consideró que el grado en que la cloroquina atraviesa la barrera hematoencefálica. Los factores más importantes que determinan la administración de fármacos a partir de sangre en el SNC son solubilidad en lípidos, masa molecular y carga (16). La BBB normal, inhibe el paso de fármacos solubles en agua con una masa molecular superior a 180 Da. La cloroquina (516 Da) es libremente soluble en agua e insoluble en alcohol, benceno, cloroformo o éter. Nuestros experimentos revelaron que la cloroquina no cambió la MTD de DT intracerebral inyectado y no redujo el daño cerebral histológica en las ratas que recibieron DT (datos no mostrados). Por otra parte, la cloroquina hizo bloquear la toxicidad de intracerebral inyectado Tf-CRM107. Las diferentes sensibilidades de intracerebral DT y Tf-CRM107 a la cloroquina sistémica es compatible con el modelo que Tf-CRM107 se dirige específicamente a las células endoteliales de los capilares. La cloroquina no atraviesa la BBB en un grado suficiente para bloquear DT y por lo tanto no deben bloquear la eficacia antitumoral de Tf-CRM107 inyecta por vía intracerebral. Nuestros investigó si la cloroquina inhibe la eficacia antitumoral de Tf-CRM107. La BBB está intacta en los bordes de la proliferación de los tumores cerebrales malignos y en regiones del cerebro infiltrado, pero es más que gotea en el centro (17). En la práctica, los estudios clínicos con la tomografía computarizada revelan que BBB permeabilidad es variable en los tumores cerebrales (18). Encontramos aquí que el tratamiento con cloroquina causa poco o ningún bloqueo de la eficacia de intratumoral Tf-CRM107 incluso en s. c. tumores del todo carente de la acreditación. La acreditación debe minimizar aún más el acceso a la cloroquina tumores cerebrales. Parece que la cloroquina puede bloquear la toxicidad a la vasculatura con poco efecto sobre la eficacia antitumoral de Tf-CRM107 en el cerebro. Aunque se conocen algunos efectos secundarios, la cloroquina ha sido generalmente considerado seguro y puede ser tomado por vía oral Once voluntarios sanos que recibieron 300 mg de cloroquina como una sola dosis por vía i. v. se quejó de infusión única de efectos secundarios subjetivos, tales como dificultades para tragar y acomodación, diplopía, y la fatiga durante la administración i. v. la infusión no se observaron efectos en el electrocardiograma, la presión arterial media, o la frecuencia del pulso (19). Los pacientes que no pueden tomar dosis orales podrían recibir cloroquina por vía intravenosa lenta infusión o por inyección s. c. o por vía intramuscular inyección (20). La tomografía computarizada y la resonancia magnética utilizando i. v. estudios mejora de contraste definir la ubicación de los tumores cerebrales debido a fugas de medios de contraste de las regiones que carecen de un BBB intacta. Aunque la resección del tumor se lleva a cabo con la mayor precisión posible de acuerdo con las exploraciones de la lesión mejora, el borde de la proliferación de tumor no de contraste mejoran porque la BBB permanece intacto y se sabe que las células tumorales de invadir centímetros más allá de la lesión mejora (21. 22. 23) . Después de la resección quirúrgica, este tumor residual en las zonas con un BBB intacta es el factor principal que subyace a la insuficiencia de los tratamientos actuales de estos pacientes. Tf-CRM107 en última instancia, puede ser mejor utilizado poco después de la cirugía para el tratamiento de esta región del cerebro infiltrado en el tumor después de la resección de todo el volumen de mejora del contraste. En esta situación, la cloroquina se debe restringir en gran medida del tumor por el BBB intacta. El i. v. inyección de cloroquina durante la infusión intracerebral de Tf-CRM107 puede proteger la vasculatura, lo que permite una menor toxicidad para el cerebro al tiempo que permite mayores dosis de Tf-CRM107 que se entregarán a tumor para mejorar aún más la tasa de respuesta de esta nueva terapia del cáncer. Damos las gracias a Pat Johnson para la asistencia y Daryl Despres por su experiencia en la manipulación de resonancia magnética.
